近日， 美國血液學(xué)學(xué)會(huì)（ASH）會(huì)議公布了一份最新的研究成果摘要，賓夕法尼亞大學(xué)Dr. Milone研究團(tuán)隊(duì)，宣布其可在短短24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生功能性CD19特異性CAR-T細(xì)胞（CART19），此方法是5天、3天CAR-T制備技術(shù)上的又一更新。該研究團(tuán)隊(duì)將于12月9日在ASH會(huì)議上公布更多的數(shù)據(jù)。
（ 圖片來源：ash.confex）
該研究的通信作者Dr. Michael Milone是賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)院和醫(yī)學(xué)院的病理學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)副教授。他于1999年從新澤西州的醫(yī)學(xué)和牙科大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位；在賓夕法尼亞大學(xué)繼續(xù)接受內(nèi)科，實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)和輸血醫(yī)學(xué)的研究生醫(yī)學(xué)培訓(xùn)；在博士后研究期間繼續(xù)科學(xué)研究；是賓大的Carl June博士CAR-T項(xiàng)目的早起原研人員，這項(xiàng)工作導(dǎo)致了對(duì)B細(xì)胞白血病和淋巴瘤患者的人工抗原受體的開放式I期研究。
（圖片來源：med.upenn.edu）
Michael Milone, MD, PhD
Associate Professor of Pathology and Laboratory Medicine
14年前，Dr. Milone與貝賽爾特董事長兼首席科學(xué)家許中偉教授是Carl June團(tuán)隊(duì)CAR-T項(xiàng)目最早的原研人員，他們研發(fā)的CTL-019最終成為了人類第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)的CAR-T藥物。許教授在參加“細(xì)胞治療國際研討會(huì)上”提道：“未來，CAR-T細(xì)胞制備的工藝極其重要。隨著細(xì)胞制備的周期不斷縮短，“24小時(shí)CAR”、甚至“vein-to-vein”CAR-T的產(chǎn)生，除了極大地降低了綜合成本，也將顛覆現(xiàn)有的生產(chǎn)模式和概念?！边@對(duì)于病情進(jìn)展迅速的患者來說是至關(guān)重要的。
許中偉教授在“2019（第十屆）細(xì)胞治療國際研討會(huì)”上提出CAR-T生產(chǎn)“vein-to-vein”模式和概念。
許中偉教授與Michael Milone在北京大學(xué)未名湖畔合影。
許教授回國后，引薦Dr. Michael Milone成為“北京大學(xué)免疫系客座教授”兼“貝賽爾特公司特約顧問”，共同為細(xì)胞免疫治療行業(yè)助力
CAR-T細(xì)胞制造過程的流程圖（圖片來源：discovery.ucl.ac.uk）
在目前的細(xì)胞治療開發(fā)過程中，盡管CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)通過各種制造方法進(jìn)行，但所有制造方法都包括相同的共同步驟。
首先，通過白細(xì)胞分離術(shù)分離患者的白細(xì)胞（WBC）并洗滌。然后，激活T細(xì)胞，用CAR轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，擴(kuò)增至所需的細(xì)胞數(shù)量用于治療，制劑生產(chǎn)和灌裝。在對(duì)患者進(jìn)行質(zhì)量控制測(cè)試和預(yù)備性淋巴清除化學(xué)療法后，將產(chǎn)品注射到患者體內(nèi)。
（圖片來源：discovery.ucl.ac.uk）
白細(xì)胞分離術(shù)和細(xì)胞洗滌 T細(xì)胞療法開始于通過白細(xì)胞分離法獲得患者的WBC，這是一種將白細(xì)胞與全血分離的單采血液成分術(shù)。通常采用連續(xù)或者半連續(xù)的密度梯度離心方法。在分離過程中添加的抗凝劑，紅細(xì)胞和血小板在洗滌過程中會(huì)被清除?？鼓齽┰诨罨倪^程中能夠改變細(xì)胞的特征，紅細(xì)胞會(huì)影響產(chǎn)品的臨床效果，血小板會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的聚集。洗滌后，直接使用WBCs或者WBCs經(jīng)程序降溫冷凍保存。
富集和細(xì)胞 一些研究人員使用CliniMACS系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行富集和洗滌，其中相應(yīng)的抗體與順磁珠連接。FredHutchinson Cancer研究中心和西雅圖兒童醫(yī)院為CD4＋（輔助性T細(xì)胞）和CD8+細(xì)胞（細(xì)胞毒T細(xì)胞）富集WBC，以便輸入具有確定的CD8+/CD4+細(xì)胞比例的產(chǎn)品。類似的，Brown等富集收集CD62L+細(xì)胞。MDAnderson癌癥中心發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞會(huì)阻礙T細(xì)胞的培養(yǎng)。當(dāng)NK細(xì)胞超過10%時(shí)，使用CD56+磁珠可以去除NK細(xì)胞。拉莫斯等人在具有> 95％循環(huán)白血病細(xì)胞的兩名患者中進(jìn)行CD3 +選擇，以使得能夠從含有低百分比的T細(xì)胞的單采血液成分產(chǎn)物中擴(kuò)增。
活化 在體內(nèi)，通過抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞（DC）刺激天然T細(xì)胞的增殖和分化。T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體（TCR）與位于DC細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合物之間的相互作用以及通過共刺激分子（如CD28，4-1BB和OX40）激活。為了避免與DC共培養(yǎng)繁瑣的過程，已經(jīng)開發(fā)并實(shí)施了幾種模擬T細(xì)胞天然刺激的方法。最基本的方法是加入OKT3（抗CD3單克隆抗體）和白細(xì)胞介素。
基因遞送 基因遞送可以分為病毒和非病毒的方法。在CAR-T細(xì)胞治療中，包括電轉(zhuǎn)DNA，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)以及病毒載體，尤其是慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是最常見的基因遞送方法。
擴(kuò)增 在目前的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通常增加培養(yǎng)基體積；通常通過增加袋子或燒瓶的尺寸或通過從板到燒瓶，燒瓶到靜態(tài)培養(yǎng)袋或靜態(tài)培養(yǎng)袋換成RM生物反應(yīng)器。
目前，在所有CAR-T研究機(jī)構(gòu)中，賓夕法尼亞大學(xué)接受了大多數(shù)的患者；細(xì)胞的靶點(diǎn)通常是CD19 ，起源產(chǎn)品主要是自體T細(xì)胞；大多數(shù)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的制造時(shí)間在14天；CAR-T細(xì)胞療法主要用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤。
圖表分析（ 圖片來源：discovery.ucl.ac.uk）
CAR-T細(xì)胞療法的療效取決于過繼轉(zhuǎn)移后T細(xì)胞的植入和持久性。植入和持久性的潛力與T細(xì)胞分化的狀態(tài)有關(guān)，賓大團(tuán)隊(duì)此前已經(jīng)證明減少離體培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間將限制T細(xì)胞分化并提高CAR-T細(xì)胞療法的療效。但是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)方案通常先通過TCR和共刺激受體的結(jié)合激活T細(xì)胞，然后將T細(xì)胞離體擴(kuò)增9到14天，這對(duì)于CAR-T細(xì)胞療法的療效產(chǎn)生了一定的影響。
于近期發(fā)表在ASH年會(huì)上的研究摘要，賓大團(tuán)隊(duì)描述了使用慢病毒載體可在一天內(nèi)產(chǎn)生功能性CD19特異性CAR-T細(xì)胞（CART19），而無需事先激活T細(xì)胞。該摘要顯示了使用非優(yōu)化過程，可以使用表達(dá)紅外紅色熒光蛋白（iRFP）的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)平均6.5％（范圍為2％-10％）的新鮮分離的靜態(tài)T細(xì)胞，與活化的T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，表達(dá)動(dòng)力學(xué)更慢（靜態(tài)和活化T細(xì)胞分別在96小時(shí)和48小時(shí)達(dá)到峰值）。盡管與活化的T細(xì)胞相比效率低得多，但在所有T細(xì)胞亞群中檢測(cè)，其中央記憶T細(xì)胞顯示出最大的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；與未處理的T細(xì)胞相比，平均轉(zhuǎn)導(dǎo)率高4倍。
賓大團(tuán)隊(duì)證明了即使沒有逆轉(zhuǎn)錄或整合酶功能，CAR表達(dá)也可以在靜態(tài)的T細(xì)胞中發(fā)生，即所謂的“偽轉(zhuǎn)導(dǎo)”。重要的是，賓大團(tuán)隊(duì)證明了該表達(dá)產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞具有溶細(xì)胞活性和效應(yīng)細(xì)胞因子，對(duì)抗原的反應(yīng)類似于激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞。
（ 圖片來源：ash.confex）
該研究團(tuán)隊(duì)使用公認(rèn)的急性淋巴母細(xì)胞白血病Nalm6模型進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)由靜態(tài)T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)16小時(shí)后洗滌去除載體產(chǎn)生的CART19細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性的抗白血病活性，該活性只要注射小劑量即可持久2x10^5個(gè)T細(xì)胞。
利用慢病毒載體將基因轉(zhuǎn)移到靜態(tài)T細(xì)胞的能力，描述的高度簡(jiǎn)化的制造方法具有增強(qiáng)治療效力的潛力，同時(shí)還大大降低了成本。此外，這種制造方法還可能擴(kuò)大接受療法的患者數(shù)量。
文章來源：
1.https://ash.confex.com/ash/2019/webprogram/Paper131147.html 2.https://discovery.ucl.ac.uk/id/eprint/10050033/1/Veraitch_20180109_CAR%20T%20cell%20manufacturing%20Review%20-%20Revision.pdf 3.https://www.med.upenn.edu/cci/milonelab/
