近年來，CAR-T療法在血液瘤治療方面表現(xiàn)出令人鼓舞的結(jié)果，2017年美國FDA批準(zhǔn)了兩款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品上市，極大地鼓舞了細(xì)胞免疫治療研發(fā)熱情，CAR-T療法在某些血液腫瘤中具有顯著的療效，并預(yù)示著腫瘤治療模式的變革。CAR-T細(xì)胞療法在其它惡性腫瘤方面也進(jìn)行了深入的研究，部分產(chǎn)品已開展了早期臨床試驗，以評估CAR-T細(xì)胞的安全性和有效性。FDA規(guī)定CAR-T細(xì)胞臨床試驗樣品必須經(jīng)IND批準(zhǔn)在GMP條件下生產(chǎn)。
GMP法規(guī)見美國Federal Regulations第21篇的各個章節(jié)。它們涵蓋各種產(chǎn)品的制造，包括食品、小分子藥物等。CAR-T最相關(guān)的章節(jié)在第210和211部分中介紹，在FDA指南“CGMP for Phase I Investigational Drugs”中簡要介紹了用于早期臨床試驗的生產(chǎn)要求。討論的關(guān)鍵領(lǐng)域如表1所示，其中包括一個專門的章節(jié)，涵蓋與細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品相關(guān)的問題。
表1 FDA關(guān)于藥物臨床I期CGMP指南主要內(nèi)容
用于制造、加工或包裝CAR-T的任何建筑或設(shè)施應(yīng)具有適當(dāng)?shù)某叽?、位置，并采用適當(dāng)?shù)臐崈羰壹壊牧辖ㄔ?，以確保適當(dāng)?shù)那鍧?、維護(hù)和生產(chǎn)操作。制造設(shè)施中的每個指定工作區(qū)域必須有適當(dāng)?shù)目臻g供設(shè)備、材料和人員移動，以防止不同部件、過程中材料或不同CAR-T產(chǎn)品之間的混合，從而有助于防止污染。如果使用多產(chǎn)品制造設(shè)施，則需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕徊嫖廴狙芯框炞C。
CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品、病毒載體和質(zhì)粒的生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)分別在各自獨立的生產(chǎn)區(qū)域進(jìn)行，并配備獨立的空調(diào)凈化系統(tǒng)。采用密閉設(shè)備、管路進(jìn)行細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)操作；密閉設(shè)備、管路安置環(huán)境的潔凈度級別可適當(dāng)降低。同一生產(chǎn)區(qū)域有多條相同的生產(chǎn)線，且采用隔離器的，每個隔離器應(yīng)當(dāng)單獨直接排風(fēng)。細(xì)胞治療產(chǎn)品、病毒載體、質(zhì)粒的生產(chǎn)操作環(huán)境的潔凈度級別，可參照表格中的示例進(jìn)行選擇。
每個B實驗區(qū)域的空氣壓力保持在+50Pa大氣壓，每個級別的實驗區(qū)域都有一個10-15Pa的空氣級聯(lián)，沒有空氣再循環(huán)；新鮮空氣通過終端Hepa過濾器進(jìn)入每個實驗區(qū)域，并通過低水平抽風(fēng)器排出。換氣速率從B實驗區(qū)的70ac/H到D實驗區(qū)的28ac/H不等。每個II類微生物安全柜和提供A級環(huán)境的QUBE隔離器都進(jìn)行連續(xù)的顆粒監(jiān)測。每個實驗室都要與其他實驗室完全隔離，以便用汽化過氧化氫進(jìn)行熏蒸。
目前CAR-T產(chǎn)品常見的生產(chǎn)環(huán)境有兩種：B+A和C+A（隔離器），需要明確的是，無論是哪種實現(xiàn)形式，按照無菌生產(chǎn)要求，所有生產(chǎn)環(huán)節(jié)不能離開A級環(huán)境，這就要求對無菌生產(chǎn)要有充分的理解，否則將面臨合規(guī)性方面的挑戰(zhàn)。
B+A是大家首先考慮的生產(chǎn)環(huán)境實現(xiàn)形式，但這種方式面臨一個問題是不能保證全程在A級環(huán)境下完成。C+A是現(xiàn)階段CAR-T產(chǎn)品無菌生產(chǎn)的一種理想方案。細(xì)胞制品生產(chǎn)過程中的隔離措施以隔離器為最佳，無菌生產(chǎn)的隔離器對環(huán)境的要求可以降低，而且可以將離心、培養(yǎng)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)集成在隔離器內(nèi)，實現(xiàn)全程的A級隔離。
在這些區(qū)域使用的材料和設(shè)備必須盡量減少顆粒物（使用潔凈室級鋼、其他材料等）和生物或化學(xué)污染的機會。應(yīng)監(jiān)測周期性好氧和厭氧微生物負(fù)荷。
圖1 GMP廠房設(shè)計
空氣處理裝置必須配備適當(dāng)?shù)脑O(shè)備，并通過書面文件、測試和定期維護(hù)對區(qū)域等級進(jìn)行驗證。不同等級區(qū)域的空氣處理裝置應(yīng)根據(jù)其各自的管道而有所不同。
生產(chǎn)區(qū)和灌裝區(qū)必須明確劃分和隔離（必須保持人員和物料流動的標(biāo)準(zhǔn)操作程序）。必須將適當(dāng)?shù)念w粒計數(shù)器、微生物傳感器、空氣流量傳感器等放置在制造設(shè)施的工作區(qū)域，并保存記錄。
用于生產(chǎn)的潔凈室區(qū)域內(nèi)的所有儀器必須有校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并提供定期維護(hù)的文件。設(shè)施必須定期進(jìn)行空氣過濾器、儀器等的維護(hù)驗證，以確認(rèn)指定的分類區(qū)域的維護(hù)。
工藝標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程必須包括安全方法，防止污染，定期測試污染物、微粒和風(fēng)險最小化的方法。生產(chǎn)過程中的所有數(shù)據(jù)必須在有權(quán)限訪問下安全存儲，并在評估過程中提供。
生產(chǎn)負(fù)責(zé)人應(yīng)當(dāng)具有相應(yīng)的專業(yè)知識（如微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等），至少具有三年從事生物制品或細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)或質(zhì)量管理的實踐經(jīng)驗。質(zhì)量負(fù)責(zé)人和質(zhì)量受權(quán)人應(yīng)當(dāng)具有相應(yīng)的專業(yè)知識，至少具有五年生物制品或細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量管理的實踐經(jīng)驗，從事過生物制品或細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量保證、質(zhì)量控制等相關(guān)工作。
從事細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量保證、質(zhì)量控制及其他相關(guān)人員（包括清潔、維修人員）應(yīng)當(dāng)經(jīng)過接受良好的無菌程序、污染物測試、生產(chǎn)過程（根據(jù)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）和維護(hù)所有過程相關(guān)文件方面的培訓(xùn)。尤其是預(yù)防經(jīng)供體材料傳播疾病方面的知識，以防止傳染性疾病的病原體在物料、產(chǎn)品和人員之間傳播以及對環(huán)境潛在的影響。
負(fù)責(zé)制造、相關(guān)工藝、包裝或搬運的人員必須在制造設(shè)施內(nèi)始終穿著干凈、安全和適當(dāng)?shù)囊路?，并保持無菌條件（應(yīng)制定人員進(jìn)出的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）。必要時，應(yīng)穿戴覆蓋身體、頭部、面部、手和手臂的防護(hù)服，以防止產(chǎn)品受到污染（必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）。員工必須養(yǎng)成良好的衛(wèi)生和健康習(xí)慣。從事質(zhì)粒和病毒載體制備和細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的人員不得穿越不同的生產(chǎn)區(qū)域。
4.1 生產(chǎn)流程
在設(shè)計CAR-T 細(xì)胞制造SOP時，特別建議開發(fā)一個封閉的，或功能封閉的制造過程，以降低產(chǎn)品污染的風(fēng)險。
圖2 CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)流程
從在簡單的T瓶和細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)到在復(fù)雜的生物反應(yīng)器中制備，理想的系統(tǒng)應(yīng)該在功能上是封閉的，以減少污染的風(fēng)險，因此，大多數(shù)研究人員已經(jīng)放棄使用T形瓶。目前，應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)設(shè)備是G-Rex（Wilson Wolf Manufacturing）、Wave biorector（GE Life Systems）和CliniMACS Prodigy（Miltenyi Biotec）。
G-Rex專為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計，氧氣從底部透氣膜滲透進(jìn)入培養(yǎng)體系，細(xì)胞自然沉降至培養(yǎng)瓶底部，葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)自然對流至細(xì)胞，細(xì)胞可以用GatherRex（Wilson Wolf Manufacturing）收集至轉(zhuǎn)移包中進(jìn)行下游處理。
圖3 符合GMP要求的CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)裝置G-Rex及GatherRex
旭日（Wave）生物反應(yīng)器是一個自動化的封閉系統(tǒng)，由一個放置在搖擺平臺上的透氣細(xì)胞培養(yǎng)袋組成。該系統(tǒng)配備流量控制器、氣體壓力傳感器、pH、氧氣和二氧化碳濃度傳感器等裝置。已經(jīng)成功地用于生產(chǎn)CAR-T，該系統(tǒng)可用于生產(chǎn)1-1000升的產(chǎn)品。
CliniMACS Prodigy全自動多功能細(xì)胞處理系統(tǒng)符合歐盟GMP標(biāo)準(zhǔn)，全封閉操作系統(tǒng)，取代傳統(tǒng)方案中多個人工操作環(huán)節(jié)及相應(yīng)的儀器設(shè)備，輕松實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、全自動CAR-T細(xì)胞制備過程，包括細(xì)胞富集、轉(zhuǎn)導(dǎo)、洗滌和擴增，是目前應(yīng)用最廣泛的自動化設(shè)備。在Prodigy裝置中，MACS CD4和CD8用于細(xì)胞富集，CD3/CD28試劑用于激活，慢病毒載體用于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些細(xì)胞在TexMACS培養(yǎng)基-3%HS-IL2中培養(yǎng)，洗滌步驟采用PBS/EDTA緩沖液。用Prodigy裝置對起始細(xì)胞進(jìn)行洗滌，去除血小板，富集CD4+和CD8+細(xì)胞。約10%的CD8+ NK細(xì)胞經(jīng)CD3/CD28活化和擴增后大量清除。
4.2 生產(chǎn)控制
企業(yè)應(yīng)當(dāng)建立書面操作規(guī)程，規(guī)定供體材料和產(chǎn)品在接收、運輸、生產(chǎn)、檢驗、放行、發(fā)放過程中正確標(biāo)識與核對標(biāo)識信息的操作和記錄，確?？勺R別供體且具有唯一性的編號代碼，不會發(fā)生標(biāo)識錯誤或遺漏，且具有可追溯性。企業(yè)應(yīng)當(dāng)制定供體篩查標(biāo)準(zhǔn)，制訂供體材料采集、運輸、接收標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，詳細(xì)說明供體材料的采集方法、保存和運輸條件以及接收的標(biāo)準(zhǔn)。
產(chǎn)品生產(chǎn)過程中應(yīng)當(dāng)采取措施盡可能防止污染和交叉污染，如：采用含有傳染性疾病病原體的自體供體材料進(jìn)行生產(chǎn)的，其生產(chǎn)、轉(zhuǎn)運過程中不得接觸其它不含有傳染性疾病病原體的供體材料或產(chǎn)品；未采用密閉設(shè)備、管路生產(chǎn)的，不得在同一區(qū)域內(nèi)同時進(jìn)行多個產(chǎn)品或多個批次的生產(chǎn)操作，但產(chǎn)品已密封的培養(yǎng)操作除外；采用密閉設(shè)備、管路在多條生產(chǎn)線上同時生產(chǎn)同一品種的多個批次時，應(yīng)當(dāng)采取有效措施規(guī)范人員、物料和廢棄物的流向；在密閉條件下進(jìn)行細(xì)胞?
