干細(xì)胞的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，涵蓋了基于細(xì)胞的高通量藥物篩選、細(xì)胞移植和器官移植等應(yīng)用領(lǐng)域，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。干細(xì)胞行業(yè)，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞治療的快速發(fā)展，方興未艾。
隨著對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞治療機(jī)理的深入研究，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)外泌體來(lái)發(fā)揮治療作用，從而推動(dòng)了干細(xì)胞外泌體的研究和發(fā)展。
2013年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了三位科學(xué)家，表彰其在細(xì)胞間囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制領(lǐng)域作出的突出貢獻(xiàn)。諾獎(jiǎng)的肯定，使得胞外囊泡及其生理學(xué)功能成為熱點(diǎn)，得到廣泛研究。
不同類型的細(xì)胞均可通過(guò)出芽方式釋放各種各樣的囊泡（如外泌體、微囊泡、凋亡小體）到細(xì)胞外，囊泡大小從40nm到毫米不等，統(tǒng)稱為胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）。
EV的外層為磷脂膜，內(nèi)層由特定類型的蛋白質(zhì)組成，包括酶、生長(zhǎng)因子、受體、細(xì)胞因子、脂質(zhì)、RNA和代謝物。直徑30～150nm的胞外囊泡，即為外泌體（exosome）。
早在20世紀(jì)60年代，EV的生理特性得到闡述，EV可在細(xì)胞、器官之間，甚至有機(jī)體之間傳遞信息，在血液、尿液、腦脊液、母乳和唾液等體液中均能檢測(cè)到。具有運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移生物活性分子，介導(dǎo)靶向細(xì)胞間信號(hào)傳遞、遺傳信息的功能性轉(zhuǎn)移等作用。
間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）分泌大量的EV，EV內(nèi)容物包括蛋白和RNA（＞80%），以及一些小RNA，其中miRNAs約44%、tRNA約47%。MSC通過(guò)EV與其他細(xì)胞實(shí)現(xiàn)信息交流，發(fā)揮治療作用。MSC-EV可表達(dá)MSC表型標(biāo)記，如CD29、CD73、CD44和CD105。
已在MSC-EV中發(fā)現(xiàn)850多個(gè)獨(dú)特的基因產(chǎn)物和160多個(gè)miRNAs。
MSC-EV已在幾種不同類型的疾病中顯示出令人鼓舞的治療效果，包括腎損傷、心臟損傷、腦損傷和肝肺損傷等。主要機(jī)制可能是MSC-EV介導(dǎo)了MSC的旁分泌/自分泌機(jī)制。
急慢性腎損傷方面，MSC-EV中的生長(zhǎng)因子mRNA可轉(zhuǎn)移到順鉑損傷的近端腎小管上皮細(xì)胞（PTEC），促進(jìn)PTEC增殖；IGF-1R的mRNA通過(guò)體外水平轉(zhuǎn)移到腎小管上皮細(xì)胞，增強(qiáng)了腎小管細(xì)胞對(duì)局部產(chǎn)生的IGF-1的敏感性。如果骨髓MSC-EV的miRNA耗竭，則在急性腎損傷中MSC-EV的再生修復(fù)能力顯著降低，提示在急性腎損傷恢復(fù)中，miRNAs起著關(guān)鍵作用。
心肌梗死方面，體外擴(kuò)增的MSC培養(yǎng)上清液已成功用于縮小小鼠心肌梗死范圍。MSC上清液的促再生活性被證明為EV組分，去除EV后則沒(méi)有作用效果。MSC-EV介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用可減輕大腸桿菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷和低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓。MSC-EV還展示了減輕藥物誘導(dǎo)肝損傷和肝纖維化的能力。
MSC-EV可直接促進(jìn)血管生成。在大鼠模型中，MSCEV可顯著改善后肢缺血灌注，加速皮膚燒傷后的再上皮化，并提高同種異體皮膚移植物的存活率。在中風(fēng)模型缺血性閉塞后，MSC-EV給藥可促進(jìn)功能恢復(fù)和新生血管，顯著改善卒中誘導(dǎo)后的功能，但是MSC組和MSC-EV組沒(méi)有明顯的療效差異。
在綿羊模型中，應(yīng)用MSC-EV可觀察到大腦缺氧損傷的改善。miRNA-133b似乎與MSC-EV介導(dǎo)的大鼠缺血性卒中后的功能恢復(fù)有關(guān)，而miRNA-22似乎與MSC-EV介導(dǎo)的缺血性心臟病心肌細(xì)胞的抗凋亡作用有關(guān)。
因此，MSC-EV可用于中風(fēng)的治療，作為干細(xì)胞輸注的替代方法，改善神經(jīng)預(yù)后，增加血管與神經(jīng)生成。
MSC-EV對(duì)多種類型的免疫細(xì)胞均具有免疫調(diào)節(jié)作用，包括樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在關(guān)節(jié)炎模型中，MSC-EV體內(nèi)炎癥抑制作用比MSC更強(qiáng)。
MSC-EV的免疫調(diào)節(jié)作用包括：1）通過(guò)miRNAs介導(dǎo)DC的免疫調(diào)節(jié)；2）通過(guò)增強(qiáng)M2巨噬細(xì)胞極化和間接驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)揮免疫抑制作用；3）抑制健康供者和GvHD患者NK細(xì)胞和其他外周白細(xì)胞的激活；4）在體外與PBMC共培養(yǎng)時(shí)抑制T細(xì)胞的激活，促進(jìn)調(diào)節(jié)性CD4+、CD25+、FOXp3+、T細(xì)胞的增殖；5）高度表達(dá)GVHD改善相關(guān)的多種可溶性因子，靜脈輸注MSC-EV可抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)，從而延長(zhǎng)GVHD小鼠模型的存活時(shí)間，并減少多個(gè)器官的病理?yè)p傷。
在小鼠體內(nèi)的生物發(fā)光和熒光介導(dǎo)的斷層成像顯示，EV靜脈注射主要分布在脾、肝、肺和腎，30分鐘內(nèi)在腦、心臟和肌肉中可檢測(cè)到EV，60分鐘后尿液中可檢測(cè)到EV。
已經(jīng)觀察到，MSC-EV的促腫瘤和抗腫瘤作用，目前尚無(wú)給藥的任何副作用報(bào)道，可以認(rèn)為MSC-EV給藥基本上安全，且由于EV不能自我復(fù)制，無(wú)內(nèi)源性腫瘤形成潛力。
2011年，進(jìn)行了第一次有記錄的臨床MSC-EV給藥，MSC-EV以遞增的劑量應(yīng)用于1例類固醇耐藥的GVHD患者，4×107個(gè)MSC培養(yǎng)上清液分離的MSC-EV（1.3-3.5×10*10個(gè)顆?；?.5～1.6mg）被定義為1個(gè)單位，每隔2~3天靜脈注射一次，共2周，總共接受4個(gè)單位，GVHD癥狀顯著下降，每日類固醇劑量可從125mg減少到30mg，治療后穩(wěn)定了5個(gè)月，MSC-EV給藥耐受性良好，未觀察到副作用。
對(duì)20例慢性腎臟病患者進(jìn)行的Ⅱ/Ⅲ期臨床研究表明，臍帶MSC-EV（輸注2次，相隔1周）可改善腎小球?yàn)V過(guò)率、血肌酐水平、血尿素和尿白蛋白肌酐比值，伴隨著TGF-β1、IL-10水平明顯升高和血漿TNF-α水平顯著下降，沒(méi)任何副作用。
MSC-EV用于8例患者牙槽骨再生研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)不良反應(yīng)，放射學(xué)評(píng)估顯示所有病例均有早期骨形成，注射部位的炎性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)很少，研究證明MSC-EV在骨再生方面具有較大的潛力。
對(duì)7例長(zhǎng)期存在大型特發(fā)性難治性黃斑裂孔患者，年齡51～75歲，行玻璃體切除、內(nèi)界膜剝離、MSC（2例）或MSC-EV（5例）玻璃體腔內(nèi)注射；5例MH閉合術(shù)患者最佳矯正視力提高，其中1例接受MSC治療的患者在視網(wǎng)膜表面觀察到纖維膜，1例接受較大劑量MSC-EV的患者出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。
MSC-EV具有免疫調(diào)節(jié)活性并促進(jìn)再生過(guò)程，其方式顯然與MSC相當(dāng)。因此，基于EV的無(wú)細(xì)胞療法，為多種疾病提供了一種基于干細(xì)胞治療的有前途的替代方案。與細(xì)胞療法相比，EV療法具有一些優(yōu)勢(shì)，但由于該領(lǐng)域的新穎性，其臨床分級(jí)生產(chǎn)、質(zhì)量保證和應(yīng)用缺乏國(guó)際公認(rèn)的指南。
改變MSC的培養(yǎng)環(huán)境，用不同的外界刺激預(yù)處理，這不僅可以影響EV的產(chǎn)量，還可以調(diào)節(jié)它們的成分。例如，中風(fēng)患者血清培養(yǎng)或缺血腦組織提取液處理，都可激活MSC釋放更多的EV。MSC培養(yǎng)時(shí)給予炎癥刺激，將增強(qiáng)抗炎特性的EV釋放。
與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)相比，微載體3D培養(yǎng)中，MSC分泌更高的EV，并降低整合素的表達(dá)。3D培養(yǎng)在MSC-EV生產(chǎn)中可能優(yōu)勢(shì)，包括：1）需要大量的培養(yǎng)基才能獲得大量臨床使用的EV；2）持續(xù)的培養(yǎng)基灌流，可避免代謝副產(chǎn)物的積累；3）控制進(jìn)出生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基流量可連續(xù)產(chǎn)出。
超速離心是收集EV最常用、最常規(guī)的方法。市面上可買到一種快速、簡(jiǎn)單的試劑盒，其分離方法相對(duì)粗糙、易引起可溶性蛋白污染。
超速離心方法可獲得純EV用于科研，但在臨床上耗時(shí)長(zhǎng)，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。超速離心聚集囊泡，易于分離到可溶性因子和蛋白質(zhì)?；诿芏忍荻鹊姆蛛xEV，效率最高。一些新興的技術(shù)，如尺寸排除色譜、聲學(xué)分離、納米捕捉器、流場(chǎng)流動(dòng)分級(jí)，都有可能從不同的樣品基質(zhì)中分離出EV。
EV的質(zhì)量保證是后續(xù)治療的基礎(chǔ)。雖然有研究表明，MSC-EV發(fā)揮了治療作用，且無(wú)副作用，但必須建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以確保所產(chǎn)生的EV產(chǎn)品的質(zhì)量、安全性和有效性得到保障。如EV應(yīng)儲(chǔ)存在等滲緩沖液中，以防止儲(chǔ)存和凍融循環(huán)期間的pH變化。
干細(xì)胞外泌體的深入研究有助于闡述干細(xì)胞治療的精準(zhǔn)機(jī)制，而且干細(xì)胞外泌體有可能在治療應(yīng)用領(lǐng)域替代干細(xì)胞。干細(xì)胞外泌體（特指MSC-EV）是一個(gè)研究和應(yīng)用都值得期待的好方向，但是需要腳踏實(shí)地地去做些工作。
因此，為了開(kāi)發(fā)基于EV的藥物，至少需要在以下方面產(chǎn)生突破：1）適用于大規(guī)模制備、純化和儲(chǔ)存的分離方案；2）量化、分子和物理表征的標(biāo)準(zhǔn)化方案；3）明確的臨床使用質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
本文來(lái)源于《醫(yī)學(xué)參考報(bào)》干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)頻道2020-04期第4版文章