Cell：超11年追蹤揭示免疫壓力對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)化的作用
免疫評(píng)分（ImmunoScore, IS）：是一種將腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的密度進(jìn)行量化的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷具有重要的價(jià)值，目前已被證明可預(yù)測(cè)早期和晚期結(jié)直腸癌患者的臨床結(jié)果。
免疫編輯（Immunoediting）：2002年，免疫學(xué)家Schreiber和Dunn提出了著名的“腫瘤免疫編輯學(xué)說”，即免疫系統(tǒng)抑制腫瘤生長的同時(shí)腫瘤的惡性程度逐漸強(qiáng)化，在免疫系統(tǒng)和腫瘤的相互作用中，免疫系統(tǒng)發(fā)揮著雙重作用：在腫瘤發(fā)展過程中免疫系統(tǒng)會(huì)依次出現(xiàn)免疫清除、免疫平衡和免疫逃逸三個(gè)階段，免疫系統(tǒng)既發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，同時(shí)又對(duì)其進(jìn)行壓力選擇，使得腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫重塑而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
腫瘤微環(huán)境（Tumor Microenvironment, TME）：是腫瘤細(xì)胞賴以生存和發(fā)展的復(fù)雜環(huán)境，腫瘤微環(huán)境由細(xì)胞成分和非細(xì)胞成分組成。其中細(xì)胞成分包括腫瘤細(xì)胞本身、炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及與腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞等；非細(xì)胞成分主要包括細(xì)胞因子，趨化因子等。如今研究火熱的腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑針對(duì)的就是所處腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，扭轉(zhuǎn)微環(huán)境中免疫抑制的現(xiàn)況，再度恢復(fù)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊能力從而起到抗腫瘤效應(yīng)。
免疫豁免（Immune-Privileged）：是指機(jī)體某些部位對(duì)外來抗原及自身抗原免疫反應(yīng)很弱，以防止因免疫反應(yīng)引起的組織損傷和功能紊亂。免疫豁免區(qū)即發(fā)生免疫排斥較弱的區(qū)域，包括眼球晶狀體，睪丸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。這些區(qū)域可能因?yàn)殚L期缺乏抗原提呈細(xì)胞的刺激致使細(xì)胞表面缺乏特異性受體而無法與免疫細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答或者只發(fā)生較弱的應(yīng)答反應(yīng)。
超長時(shí)間以及相對(duì)大量的切除樣本跟蹤分析腫瘤克隆進(jìn)化，建立一個(gè)平行選擇模型解釋免疫編輯對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)化的作用。
免疫評(píng)分和免疫編輯可描繪不同的免疫逃逸機(jī)制
非復(fù)發(fā)性克隆是受免疫編輯的；進(jìn)展中的克隆具有免疫豁免性
免疫編輯和免疫指數(shù)是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的兩個(gè)最佳預(yù)測(cè)因子
平行選擇模型描述了克隆免疫編輯和腫瘤進(jìn)化
研究人員假設(shè)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)展和克隆進(jìn)化是由腫瘤內(nèi)在特征以及外在免疫壓力介導(dǎo)的，遵循達(dá)爾文選擇的腫瘤克隆基礎(chǔ)，即在免疫清除期根除高免疫原性腫瘤克隆，而選擇具有低免疫原性和抗免疫攻擊性的腫瘤細(xì)胞變體進(jìn)入平衡期。
據(jù)此，研究人員試圖對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（CRC）患者進(jìn)行為期11年的隨訪，研究免疫壓力如何影響轉(zhuǎn)移腫瘤的進(jìn)化。
該研究描述了不斷演變的轉(zhuǎn)移基因組和免疫微環(huán)境，同時(shí)描述了免疫監(jiān)視、逃逸、克隆傳播與腫瘤進(jìn)展之間的聯(lián)系。在此，研究人員提出了在轉(zhuǎn)移過程中腫瘤進(jìn)化的平行選擇模型，其進(jìn)展取決于局部免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和質(zhì)量。
實(shí)驗(yàn)選取2例IV期CRC患者的31例轉(zhuǎn)移灶作為縱向數(shù)據(jù)集，這2名患者存活時(shí)間極長。在疾病進(jìn)展中，對(duì)2名患者P210和P45的轉(zhuǎn)移灶內(nèi)與灶間不同的時(shí)間部位進(jìn)行取樣（包括完全切除的原發(fā)腫瘤，同步及異時(shí)轉(zhuǎn)移灶），共36個(gè)樣本，并通過全外顯子組測(cè)序、免疫組化（IHC）淋巴譜系標(biāo)記物定量來進(jìn)行基因組和腫瘤微環(huán)境表征，用以評(píng)估轉(zhuǎn)移內(nèi)、轉(zhuǎn)移間和患者間的基因組和免疫異質(zhì)性。
圖1：兩名患者的取樣分布
圖2：IHC全片數(shù)字掃描和標(biāo)記物復(fù)合熒光成像
實(shí)驗(yàn)使用Parsimony Ratchet方法構(gòu)建系譜樹?？傮w而言，與從解剖學(xué)上分離的轉(zhuǎn)移相比，來自相同轉(zhuǎn)移位置的樣本在系統(tǒng)發(fā)育上更接近并且共享更多突變。
圖3：基于原發(fā)和轉(zhuǎn)移樣本一致突變的系譜樹
接下來根據(jù)編碼突變譜的相似性推斷出每個(gè)轉(zhuǎn)移的起源，父子關(guān)系由最高的Jaccard相似系數(shù)定義。然后，從診斷時(shí)間到最后一次隨訪，用轉(zhuǎn)移灶進(jìn)化系譜樹顯示轉(zhuǎn)移性傳播的途徑，每個(gè)樣本用圓圈表示，圓圈大小表示腫瘤尺寸大小，外圈顏色為切除位點(diǎn)，內(nèi)圈顏色表示免疫指數(shù)（HS和WS）。在患者P210中，腫瘤部位M10-b3是大體積轉(zhuǎn)移M10的組成部分，但其起源不同于從相同轉(zhuǎn)移（M10-b1/-b2/-b4）取樣的其余區(qū)域，表明M10是多步定植的結(jié)果。值得注意的是，在兩名患者中，只有一例同一時(shí)期轉(zhuǎn)移擴(kuò)大為轉(zhuǎn)移譜系：P210中的M6和P45中的M3，表明一些轉(zhuǎn)移灶比其他轉(zhuǎn)移灶更具攻擊性。
圖4：轉(zhuǎn)移灶傳播樹形圖
盡管有線性進(jìn)化模型的跡象，但存在平行進(jìn)化的要素，例如原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的高水平遺傳分化。此外，在轉(zhuǎn)移M6中觀察到TP53的平行進(jìn)化，其中在兩個(gè)不同的克隆中檢測(cè)到兩個(gè)突變的基因座（患者P210的持續(xù)型克隆1和消除型克隆12）。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)觀察到在幾個(gè)轉(zhuǎn)移瘤中，獨(dú)特的腫瘤克隆正在進(jìn)行進(jìn)化。 此外，患者P210在空間異質(zhì)性M10樣品中存在不同的腫瘤克隆現(xiàn)象，這也證明了轉(zhuǎn)移灶內(nèi)克隆的異質(zhì)性。
基因組印記變化方面，通過將測(cè)序覆蓋度、拷貝數(shù)變異和腫瘤純度整合來估計(jì)給定體細(xì)胞突變的細(xì)胞流行率，可計(jì)算得到12種不同的腫瘤克隆。其中，沒有檢測(cè)到原發(fā)病灶的主克隆，可能的原因是原發(fā)腫瘤的取樣有限，然而疾病進(jìn)展期間最持久的克隆可追溯到原發(fā)性腫瘤。
圖5：腫瘤克隆進(jìn)化圖
對(duì)于這兩位患者而言，在隨訪時(shí)間線上某一點(diǎn)發(fā)展的12種不同的腫瘤克隆超過克隆檢測(cè)閾值10％，具有相似克隆突變的轉(zhuǎn)移灶在解剖學(xué)上，時(shí)間上和系統(tǒng)發(fā)育上密切相關(guān)。
圖6：腫瘤克隆超過檢測(cè)閾值的10%
為了闡明免疫背景，實(shí)驗(yàn)通過單重IHC，多光譜成像和多重免疫基因表達(dá)來檢測(cè)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞。總體而言，P210和P45轉(zhuǎn)移灶的表型差異較大。
圖7：免疫細(xì)胞密度柱狀圖
單獨(dú)對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行免疫編輯評(píng)分，把觀察到的每個(gè)非同義突變作為預(yù)估的免疫原性突變比率，通過繪制免疫編輯評(píng)分(Yes/No)及相應(yīng)的免疫評(píng)分值(Hi/Lo)定義四類轉(zhuǎn)移瘤：HiYes、HiNo、LoYes和LoNo。高于預(yù)估的免疫原性突變率表明缺乏免疫編輯和免疫耐受（得分>0.8，n=24）。
圖8：免疫編輯評(píng)分與免疫原性突變率
然而，54%具有高免疫評(píng)分的轉(zhuǎn)移瘤是進(jìn)行過免疫編輯的。這一結(jié)果表明，免疫浸潤是免疫編輯發(fā)生的必要不充分條件，并且免疫編輯發(fā)生在轉(zhuǎn)移期。此外，免疫編輯與各類T細(xì)胞表型（如細(xì)胞毒性，粘附，Th1，Tfh，CD8細(xì)胞，趨化因子CCL2，細(xì)胞因子和免疫檢查點(diǎn)等）均具有很強(qiáng)的相關(guān)性。
在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）存在下鑒定無免疫編輯的一組轉(zhuǎn)移灶揭示了腫瘤-外在逃逸的幾種機(jī)制。在HiNo組（免疫編輯評(píng)分>0.8，免疫評(píng)分>60），CT和IM顯示了FOXP3+細(xì)胞和PD-L1+細(xì)胞的密度增加，通過測(cè)量不同克隆型的數(shù)量來判斷較高的TCR-a多樣性，表明該組中T細(xì)胞克隆擴(kuò)增的缺失或不足。
圖9：免疫評(píng)分和免疫編輯揭示了不同的逃逸機(jī)制
因此，免疫編輯的轉(zhuǎn)移灶具有高免疫評(píng)分和T細(xì)胞與增殖的腫瘤細(xì)胞之間短距的特點(diǎn)，而非免疫編輯轉(zhuǎn)移灶的FOXP3+T細(xì)胞密度增加，PD-L1表達(dá)增加，以及T細(xì)胞與PD-L1+細(xì)胞顯著接近。
為了解腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的特征，根據(jù)腫瘤克隆是否已經(jīng)產(chǎn)生子代轉(zhuǎn)移將腫瘤克隆分為三組（持續(xù)型，消除型和早期非復(fù)發(fā)型）。
實(shí)驗(yàn)通過幾種基因組特征（包括Dn/Ds評(píng)分）比較了持續(xù)型和消除型腫瘤克隆，并且計(jì)算了腫瘤克隆的免疫編輯評(píng)分。值得注意的是，免疫編輯在消除型腫瘤克隆中更為常見，而免疫編輯的缺失在持續(xù)型克隆中較為普遍（只有一個(gè)來自P45克隆2的持久型克隆具有免疫編輯，而這個(gè)克隆只有一個(gè)位于ZDHHC11基因內(nèi)的免疫原性突變，其表達(dá)水平可以忽略不計(jì)）。
圖10：免疫編輯區(qū)分三型腫瘤克隆
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用免疫選擇來區(qū)分持續(xù)型和消除型克隆優(yōu)于Dn/Ds評(píng)分；來自相同轉(zhuǎn)移的不同克隆具有不同的免疫編輯評(píng)分，免疫編輯是腫瘤克隆復(fù)發(fā)較為理想的預(yù)測(cè)因子（AUC = 0.89），并且若除去P45克隆2的影響因素，則更佳（AUC = 0.98）。在具有異時(shí)轉(zhuǎn)移的卵巢癌病例中觀察到類似的結(jié)果。
最后，研究人員檢驗(yàn)了具有臨床相關(guān)性的參數(shù)，對(duì)包括臨床、基因組、免疫和空間等22個(gè)參數(shù)進(jìn)行單元變量分析。免疫編輯和免疫指數(shù)是轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的兩個(gè)有效的最佳預(yù)測(cè)因子。研究顯示，較低的免疫指數(shù)，免疫編輯的缺失和較高的轉(zhuǎn)移負(fù)荷對(duì)無復(fù)發(fā)存活率具有不利影響。
圖11：免疫編輯（左）和免疫評(píng)分（右）的單變量無復(fù)發(fā)生存曲線
通過將免疫編輯和免疫指數(shù)疊加在轉(zhuǎn)移灶傳播樹形圖上來評(píng)估免疫系統(tǒng)與腫瘤隨時(shí)間傳播之間的關(guān)系。這說明了轉(zhuǎn)移灶的局部控制（較小的尺寸）和免疫指數(shù)在預(yù)防復(fù)發(fā)中起到保護(hù)作用。因此，轉(zhuǎn)移進(jìn)展和復(fù)發(fā)時(shí)間取決于機(jī)制相關(guān)的免疫參數(shù)。
圖12：疊加免疫編輯和免疫指數(shù)的轉(zhuǎn)移灶傳播樹形圖
該實(shí)驗(yàn)通過對(duì)特長生存期（超過11年）以及相對(duì)大量的切除樣本的追蹤研究，揭示了免疫系統(tǒng)在轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程中所起到的作用：
（1）每個(gè)轉(zhuǎn)移灶本身就是一種疾病，時(shí)間及空間異質(zhì)性的轉(zhuǎn)移灶，甚至是同一轉(zhuǎn)移灶內(nèi)都存在不同的臨床反應(yīng)、基因組結(jié)構(gòu)和免疫活性，因此轉(zhuǎn)移灶不能平均化處理。 （2）實(shí)驗(yàn)通過平行選擇模型描述了轉(zhuǎn)移進(jìn)化圖譜，用以追蹤腫瘤的多種傳播途徑。然而，當(dāng)僅考慮基因組學(xué)特征時(shí)，腫瘤克隆是否易于傳播不能很好的得到解釋。 （3）實(shí)驗(yàn)在時(shí)間和空間維度分析了與腫瘤克隆相關(guān)的免疫微環(huán)境，證實(shí)了非復(fù)發(fā)性克隆是受免疫編輯的，持續(xù)型和進(jìn)展的腫瘤克隆具有免疫豁免性。這一發(fā)現(xiàn)首次揭示了克隆傳播和免疫監(jiān)視之間的關(guān)系，對(duì)治療有重要意義。靶向克隆新抗原可以通過靶向保留免疫原性突變的、持久的、未經(jīng)編輯的腫瘤克隆來預(yù)防復(fù)發(fā)。 （4）實(shí)驗(yàn)雖然可以在疾病時(shí)間表中檢測(cè)到有效的免疫激活和高免疫，但隨著時(shí)間的推移，免疫編輯的總體下降趨勢(shì)意味著腫瘤獲得免疫逃逸。越來越多的證據(jù)表明，在獲得大量突變之前，染色體不穩(wěn)定性可能是轉(zhuǎn)移的早期驅(qū)動(dòng)，患者P45由此可見，這可能導(dǎo)致新抗原的濃度稀釋和自身肽對(duì)抗原呈遞的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。在這種情況下，監(jiān)視的免疫細(xì)胞募集將被沉默，免疫編輯也將無法檢測(cè)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)未經(jīng)編輯的高免疫浸潤轉(zhuǎn)移灶也具有高倍性，分析可能的原因是腫瘤細(xì)胞已經(jīng)充滿新抗原，染色體不穩(wěn)定性在此之后。在產(chǎn)生足夠強(qiáng)的新抗原信號(hào)后，免疫細(xì)胞可被募集，但受到免疫抑制的影響，導(dǎo)致無法檢測(cè)到免疫編輯。實(shí)際上，在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）存在下缺乏免疫編輯揭示了幾種逃避機(jī)制，包括增加免疫抑制細(xì)胞的密度和從腫瘤細(xì)胞中分離免疫細(xì)胞。 （5）免疫指數(shù)、轉(zhuǎn)移灶大小以及缺乏編輯是復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的轉(zhuǎn)移性癌癥進(jìn)展的預(yù)測(cè)模型，可以正確預(yù)測(cè)兩名患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，也成功在另外獨(dú)立集上得到驗(yàn)證。 上述研究可為了解癌癥傳播和免疫治療的發(fā)展提供有效依據(jù)。 參考文獻(xiàn)：